Isabella d’Este giunse a Mantova giovanissima in sposa (1490) e a lungo visse al piano nobile del Castello, mentre il marito Francesco II abitava al piano terreno. La colta e raffinata marchesa fu uno dei personaggi simbolo del Rinascimento italiano; nell’arco di una decina d’anni riuscì a creare all’interno del maniero una serie di ambienti di grande bellezza, dei quali purtroppo rimane assai poco. Rimasta vedova nel 1519, si spostò in Corte Vecchia e allora rimosse dal Castello parte dei suoi arredi per farli ricollocare nel nuovo appartamento. Rimangono tuttavia almeno le tracce dello Studiolo e della Grotta, oltre a una serie di camerini e di stanze più ampie. Di particolare interesse è la Grotta. L’attuale volta a botte lignea copre alcune pitture con segni dello Zodiaco, realizzate quando il camerino serviva da studiolo di Ludovico II (1444-78). Oggi, l’elemento decorativo di maggior interesse è il soffitto ligneo, eseguito per la marchesa. Intagliato tra il 1506 e il 1508 dai fratelli Mola, è decorato con tabelle che figurano le pause musicali.
A partire dal 1534, la Grotta divenne il passaggio per accedere alla palazzina di Margherita Paleologa. Esattamente sopra la Grotta è lo Studiolo di Isabella d’Este, fatto decorare alla fine del Quattrocento dalla marchesa, ma rimaneggiato all’epoca di Giulio Romano. Della decorazione originale è ancora traccia nella pavimentazione, eseguita a intarsio marmoreo. Qui erano conservati alcuni dipinti di grande valore: opere di Andrea Mantegna, del Perugino, di Lorenzo Costa il Vecchio, successivamente trasportate, come gran parte dell’arredo e delle collezioni, in Corte Vecchia; dal 1628 però queste opere si trovano in Francia e si possono ammirare nel Museo del Louvre di Parigi.
Nella vicina Sala delle Armi, posta nella torre nord-est del baluardo, è attualmente conservato un polittico di Cima da Conegliano, realizzato nel 1513 per la chiesa di Sant’Anna di Capodistria.
Si sale quindi nella Cappellina del Bertani, passando per la sacrestia. La cappella divenne tale soltanto nel 1561 e fu il prefetto delle fabbriche Giovanni Battista Bertani, pittore e architetto, a conferirgli l’aspetto di un raffinato sacello, a esaltazione dell’ordine corinzio ancor più che della Vergine cui era dedicata.
Si prosegue quindi per il Passo Oscuro, che introduce in alcuni ambienti nei quali sono state rimontate le decorazioni della Palazzina della Paleologa. L’edificio venne costruito da Giulio Romano per Margherita Paleologa di Monferrato, tra il 1534 e il 1536.
Disposta su un unico piano, la palazzina era dotata anche di un giardino pensile; l’intera struttura fu abbattuta nel 1899. Le proteste di parte della cittadinanza portarono, se non altro, al distacco di alcune decorazioni pittoriche, che vennero poi negli anni venti rimontate su telai e inserite negli ambienti del piano nobile del castello dove si trovano tuttora. Tra gli ambienti conservatisi il primo è il Camerino degli Armadi, così detto per via degli stipi dipinti da un collaboratore di Giulio Romano, forse Agostino de Ganis. Tra i ricchi festoni si notino, sui peducci di volta, le rappresentazioni dei Quattro Continenti. È assai probabile che la decorazione pittorica sopra le spalliere spetti a Lorenzo Costa il Giovane (1535-83). Nel successivo ambiente sono affreschi attinenti a un Oratorio, o cappella. L’artista che dipinse tra la fine del Cinquecento e gli inizi del Seicento queste scene è generalmente riconosciuto in Anton Maria Viani, ma è invece possibile che tali pitture spettino a Ippolito Andreasi, detto l’Andreasino. Il terzo locale, detto Camerino delle Stagioni, è l’unico che conservi l’originale decorazione dipinta dalla bottega di Giulio Romano.